Forskningsprojektet levosimendan − från idé till produkt

1988 var det ursprungliga syftet med projektet att utveckla en säker substans med inodilaterande verkan. Uppenbarligen hänger substansens säkerhet mer samman med dess inverkan på hjärtat än med dess vasodilaterande effekt. Därför granskade vi först de förut kända substanserna med positiv inotropi och deras verkningsmekanismer, och försökte avgöra vad som är fel med dessa substanser.

Vissa av substanserna öppnar kalciumkanaler av L-typ, antingen direkt eller indirekt genom fosforylering av kanalerna. Till denna grupp hör PDE-hämmare som milrinon. En annan grupp av substanser är de som öppnar natriumkanaler, vilket sedan indirekt genom utbyte natrium/kalcium ger positiv inotropi. Digitalisglykosider, som hämmar natrium/kalium-ATPas ger också positiv inotropi på indirekt väg, genom utbyte natrium/kalcium. Dessutom kan substanser som förlänger aktionspotentialen genom att blockera kaliumkanaler ge positiv inotropi. Detta var läget 1988, och situationen är i stort sett densamma fortfarande. Ett gemensamt drag hos alla dessa substanser är att de ökar den intracellulära kalciumbelastningen, vilket medför en risk för spontan frigöring av kalcium ur det sarkoplasmatiska retiklet med åtföljande arytmi.

Vi beslöt därför att förkasta denna grundläggande strategi och valde en ny variant, som först föreslagits av professorerna Solaro från Chicago och Ruegg från Heidelberg1. Denna nya strategi baserades på kalciumsensibilisering av kontraktila proteiner. Det finns flera proteiner i kardiomyocyterna som reglerar kontraktionsprocessen. Den första uppgiften var därför att välja ett målprotein bland dessa.

Vi visste hur troponinkomplexets konformation ändras när kalcium binder vid troponin C. Därmed sker den tropomyocinförskjutning som gör det möjligt för myosinhuvudet att binda vid aktin. Vi insåg lätt att om vi kunde underlätta bindningen av kalcium vid troponin C så skulle vi få en bättre kontraktionstrigger utan att öka mängden intracellulärt kalcium.

Men mekanismer för kalciumsensibilisering hade en allvarlig nackdel: den skulle kunna försvåra hjärtmuskelns relaxation.

Låt oss granska situationen i detalj, genom att titta på tidsföljden för intracellulär kalciumnivå och processen kontraktion-relaxation. En substans som ökar affiniteten för kalcium hos troponin C har sin proportionellt största effekt när kalciumkoncentrationen i cytoplasma är låg och inget kalcium har bundit till troponin C. En sådan substans har alltså sin största betydelse, under den fas när kalciumnivån är på väg uppåt, och tyvärr också, när det är dags för relaxation. Vårt resonemang ledde till tanken på att utveckla en substans som skulle uppföra sig på motsatt sätt mot de medel som ökar affiniteten för kalcium hos troponin C. Substansen skulle med andra ord ha sin största effekt vid den tidpunkt när den intracellulära kalciumnivån har sitt största värde.

Vi beslöt alltså att ta fram en substans vars bindning till troponin C är kalciumberoende.

När kalcium binder till den N-terminala delen i troponin C öppnar proteinet en hydrofob ficka. En substans skulle kunna binda till denna ficka och stabilisera den kalciuminducerade konformationsändringen hos troponin C. Detta skulle då kunna vara en mekanism för kalciumsensibilisering av kontraktila proteiner.

Nästa uppgift var att utveckla en sållningsmetod som bygger på denna tanke.

Vi kom på att vi skulle kunna binda troponin C i en kromatografikolonn och köra substanserna igenom kolonnen i kalciumfri lösning respektive i en lösning med kalcium.

En substans som hålls kvar längre i kalciumlösningen än i den kalciumfria har kalciumberoende bindning till troponin C. Retentionstiden för levosimendan var nästan dubbelt så lång i en lösning med kalcium som i en lösning utan kalcium2.

Nu hade vi funnit molekyler med kalciumberoende bindning till troponin C, men vi måste också visa att bindningsstället var den aktuella hydrofoba fickan, eftersom det var endast den typen av bindning som skulle stabilisera konformationen hos troponin C.

Vi detaljstuderade därför bindningen av levosimendan till den N-terminala delen hos troponin C, med hjälp av NMR. Det visade sig att levosimendan interagerade med aminosyragrupperna i den hydrofoba fickan, och alltså att det aktuella bindningsstället var det rätta3.

Vi behövde därefter visa att bindning av levosimendan till detta bindningsställe verkligen skulle stabilisera konformationen av troponin C. Vi märkte därför troponin C med dansylklorid, så att vi fick fluorescens när kalcium inducerade en konformationsändring hos troponin C. Levosimendan försköt kalcium inducerade fluorescens kurvan åt vänster, vilket tyder på att substansen stabiliserar den kalciuminducerade konformationsändringen hos troponin C. När troponin C som genomgått punktmutation användes i ett liknande försök hade levosimendan förlorat sin verkan, vilket visar att den polära aminosyran asparaginsyra i position 88 i den annars hydrofoba fickan var nödvändig för att levosimendan skulle binda till troponin C3.

Sedan försökte vi påvisa kalciumsensibilisering med hjälp av levosimendan i avskalade fibrer från papillarmuskulatur hos marsvin. Efter tillsats av levosimendan till lösningen ökades den kontraktila kraften påtagligt. Levosimendan fungerar som kalciumsensibiliserare också i sur (pH 6.7) lösning4. I jämförelse med andra kalciumsensibiliserare var levosimendan klart effektivast. EMD 57033 var också effektivt, med sin inverkan på aktin-myosinkomplexet, medan pimobendan och MCI-154 var nästan utan effekt på dessa fibrer.

Energiförbrukningen hos kontraktila proteiner ökade inte efter tillsats av levosimendan därför levosimendan inte ökade aktiviteten hos ATPas, inte ens vid höga koncentrationer.

Nu hade vi alltså för det första påvisat att bindningen av levosimendan till troponin C var kalciumberoende, för det andra att bindningen av levosimendan skedde till den hydrofoba fickan i den N-terminala domänen av troponin C, för det tredje att bindningen till den hydrofoba fickan stabiliserade den kalciuminducerade konformationen hos troponin C, och för det fjärde att denna stabilisering innebar kalciumsensibilisering hos avskalade fibrer.

Därefter ville vi gärna se hur relaxationstiden påverkades av levosimendan. Vi hade avsatt kontraktion/relaxation mot tid hos stimulerade papillarmuskler från marsvin, för att tydligt kunna avläsa effekten av levosimendan på relaxationen. Som förväntat fördröjer inte levosimendan relaxationen.

Lancaster och Cook visade att levosimendan inte ökar den intracellulära kalciumbelastningen i intakta kardiomyocyter, genom mätning av intracellulära kalciumnivåer parallellt med kontraktilitet5. Motsvarande fynd gjordes av professor Hasenfuss grupp, vid studium av levosimendan i snitt från ventrikelmuskeln hos personer som avlidit i hjärtsvikt6.

Slutligen är vi framme vid säkerheten hos levosimendan. När vi ville undersöka substansens effekt på mortaliteten tog vi som modell för hjärtsvikt råttor med utläkta myokardinfarkter. Vi ligerade en koronarartär och råttorna fick läka skadan under sju dagar. Därefter fick de levosimendan i dricksvattnet under upp till 312 dagar. Levosimendan åstadkom en signifikant reduktion av mortaliteten 7. Kontrollsubstansen enalapril hade också effekt, medan milrinon inte hade någon effekt.

Dessa undersökningar gav oss en fast grund för fortsatt utveckling av levosimendan.


Referenser

1. Calcium regulation of muscle contraction: the molecular regulation mechanisms of contractility. Rüegg JC. Naturwissenschaften 1987;74:579-84.

2. Cardiac troponin C as a target protein for a novel calcium sensitizing drug, levosimendan. Haikala H, Kaivola J, Nissinen E, Wall P, Levijoki J, Linden IB. J Mol Cell Cardiol 1995;27:9 1859-66.

3. Binding of a new Ca2+ sensitizer, levosimendan, to recombinant human cardiac troponin C. A molecular modelling, fluorescence probe, and proton nuclear magnetic resonance study. Pollesello P, Ovaska M, Kaivola J, Tilgmann C, Lundstrom K, Kalkkinen N, Ulmanen I, Nissinen E, Taskinen J. J Biol Chem 1994;269:28584-90.

4. Mechanisms of action of calcium-sensitizing drugs. Haikala H, Linden IB. J Cardiovasc Pharmacol 1995;26(Suppl 1):510-9.

5. The effects of levosimendan on [Ca2+] in guinea-pig isolated ventricular myocytes. Lancaster MK, Cook SJ. Eur J Pharmacol 1997;339:97-100.

6. Influence of the novel inotropic agent levosimendan on isometric tension and calcium cycling in failing human myocardium. Hasenfuss G, Pieske B, Castell M, Kretschmann B, Maier LS, Just H. Circulation 1998;98:2141-7.

7. Improved survival with simendan after experimental myocardial infarction in rats. Levijoki J, Pollesello P, Kaheinen P, Haikala H. Eur J Pharmacol 2001;419:243-8.